分光光度計應(yīng)用案例分析

本文通過應(yīng)用紫外可見分光光度計研究動物試驗對裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖的祛痰作用。采用小鼠酚紅祛痰法觀察裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖的祛痰作用。裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖能增加小鼠呼吸道酚紅排泌量。實驗結(jié)果證明裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖具有一定的祛痰作用。

關(guān)鍵詞 

分光光度計；裂褶菌；胞內(nèi)多糖；發(fā)酵；酚紅祛痰法；祛痰效果

裂褶菌又名白參、樹花等，隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、裂褶菌科、裂褶菌屬，是一種食藥兼用菌^[1]。其分布廣泛，在民間被廣泛用于治療小兒盜汗、婦女白帶增多、神經(jīng)衰弱、頭昏耳鳴等癥^[2]。裂褶菌多糖是指從裂褶菌子實體、菌絲體以及發(fā)酵液中提取出來的水溶性多糖，是裂褶菌中最主要的生物活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、抗菌、抗輻射、提高機體免疫力等多種藥理活性。由單一組分的β-（1-3）-D葡聚糖組成，其中每3個葡萄糖分子上連有1個β-（1-6）的分支^[3-5]。經(jīng)研究表明，裂褶菌發(fā)酵多糖具有很好的抗炎作用。因此，推測裂褶菌發(fā)酵多糖具有祛痰的潛在功能，本研究進行了驗證性研究。

1、材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株：裂褶菌菌種由四川省綿陽市食用菌研究所提供

試驗動物：昆明種小鼠，雌性，體重（20±2）g，6周齡，由長春高新醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為10-5113

儀器：電子天平（梅特勒AL104）、UV-5100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）

試劑：陽性藥川貝枇杷糖漿，江西三九藥業(yè)有限公司，批號100305J；苯酚紅、碳酸氫鈉、氫氧化鈉為國產(chǎn)分析純

1.2試驗方法

1.2.1裂褶菌液體發(fā)酵培養(yǎng)

將配制好的綜合培養(yǎng)基分裝入容量為250mL的三角瓶內(nèi)，每瓶裝液量為100mL，121℃、20min滅菌、冷卻至室溫備用。在超凈工作臺上，每瓶接種直徑為6mm的菌餅5～7片。接種后靜置培養(yǎng)12h后置于26℃、120r/min搖床上培養(yǎng)7d^[6]，然后轉(zhuǎn)入裝有400mL綜合培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，置于26℃、120r/min搖床上培養(yǎng)7d，發(fā)酵結(jié)束后，抽濾分離菌絲體及發(fā)酵液，菌絲體60℃烘干至恒重，備用。

1.2.2 裂褶菌胞內(nèi)多糖的提取與純化

收集的菌絲體按液料比1∶5在室溫條件下用蒸餾水超聲提取1次，每次30min，超聲頻率70Hz，然后置于80℃的恒溫水浴鍋中浸提5次，浸提的時間分別為5、4、3、2、1h。合并水提液，加入0.5%的活性炭吸附20min，過濾脫碳，減壓濃縮，用3倍體積的95%乙醇進行沉淀，于4℃冰箱中靜置過夜。將獲得的白色纖維狀沉淀，復(fù)溶，用3倍體積的95%乙醇再沉淀，重復(fù)3次，收集沉淀，再用無水乙醇洗滌3次，直至析出液中無還原糖反應(yīng)為止。于60℃條件下烘干，得裂褶菌胞內(nèi)多糖^[7]。

1.3模型與數(shù)據(jù)分析

1.3.1祛痰動物模型的建立

取昆明種小鼠50只，隨機分為5組，即空白對照組、陽性藥對照組（20mL/kg）、裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖高劑量（500 mg/kg）、裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖中劑量（250 mg/kg）、裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖低劑量（125 mg/kg），每組10只。各組小鼠按體重灌胃給藥（20mL/kg），每天1次，連續(xù)給藥5d，其中空白對照組給等體積生理鹽水。試驗前各組小鼠禁食16h。末次給藥后1h后，由腹腔注射5%酚紅溶液0.2mL/10g，注射后30min脫頸椎處死小鼠，仰位固定于手術(shù)板上，剪開頸正中皮膚，分離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管。放入盛有3mL生理鹽水的試管中，再加入5%碳酸氫鈉溶液0.1 mL，使氣管段中的酚紅*釋放，用UV-5100型紫外可見分光光度計測波長在546nm范圍內(nèi)的OD值，用酚紅繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計算酚紅含量^[8-10]。

1.3.2統(tǒng)計學(xué)處理。

運用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，分析組間差異，試驗結(jié)果用（x±s）表示。

2、結(jié)果與分析

裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖對小鼠呼吸道酚紅排泌量的影響試驗結(jié)果顯示，裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖高劑量組、川貝枇杷糖漿組均能增加小鼠呼吸道酚紅排泌量，與空白對照組相比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。表明裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖具有祛痰作用（表1）。

表1 裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖對各組小鼠呼吸道酚紅排泌量的影響

3、結(jié)論與討論

祛痰的作用原理大多為增加呼吸道分泌，使痰液變稀，或降低痰液中的黏性成分，使痰液黏度下降，或增加呼吸道黏膜上皮細(xì)胞纖毛的運動，使痰液易于咳出。酚紅祛痰試驗是利用酚紅部分地從呼吸道排泄的特點，在化痰藥的作用下，隨著支氣管分泌的增加，由呼吸道黏膜排出的酚紅也增多，用分光光度計測出酚紅的排泌量，從而得知藥物化痰作用的強弱^[11]。本試驗利用酚紅作為祛痰效果指示劑，在川貝枇杷糖漿及裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖的作用下，使呼吸道黏膜排出的酚紅增加，從而證實支氣管分泌液增加。本試驗研究結(jié)果顯示，裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖高劑量組能增加小鼠呼吸道酚紅排泌量，使小鼠呼吸道分泌液明顯增加，與空白對照組相比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。表明裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖具有祛痰作用。本試驗證明了裂褶菌發(fā)酵胞內(nèi)多糖的祛痰藥理作用，為臨床合理開發(fā)應(yīng)用裂褶菌多糖提供了藥理學(xué)依據(jù)，例如祛痰糖漿。同時，為進一步地研究裂褶菌發(fā)酵多糖提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

4、參考文獻(xiàn)

[1] 卯曉嵐.中國經(jīng)濟真菌[M].北京：科學(xué)出版社，1998：48

[2] 黃年來，楊慶堯，張甫安，等.中國食用菌百科[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：119.

[3] 趙琪，袁理春，李學(xué)春.裂褶菌研究進展[J].食用菌學(xué)報，2004，11（1）：59-63.

[4] 鄧百萬，陳文強，李志洲.裂褶菌營養(yǎng)菌絲蛋白質(zhì)成分的分析[J].氨基酸和生物資源，2003，25（4）：1-2.

[5] 冀頤之，遲文鶴，杜連祥.裂褶菌胞外多糖發(fā)酵條件的研究[J].藥物生物技術(shù)，2003，10（1）：17-21.

[6] 王振河，萬學(xué)東，武忠偉，等.正交設(shè)計優(yōu)化裂褶菌發(fā)酵全液多糖提取工藝[J].中國野生植物資源，2007，26（4）：50-56.

[7] 李雪.裂褶菌液體發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物的藥理活性研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[8] 李儀奎.中藥藥理實驗方法學(xué)[M].2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：428.

[9] 安然，梁茂新.白術(shù)鎮(zhèn)咳祛痰、鎮(zhèn)痛和止血潛在作用的實驗研究[J].中醫(yī)雜志，2010，51（12）：1125-1127.

[10] 李顯華，宋達(dá)夫，甘雨，等.固本清肺貼膏對小鼠止咳、祛痰作用的實驗研究[J].實驗動物研究，2010，27（4）：40-41.

[11] 魏東，姚斌，高興亮，等.少年紅礬杏平喘糖漿鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘作用的實驗研究[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2009，19（2）：29-32.

文章內(nèi)容來源于：劉偉峰，于浩然，王琦.裂褶菌液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖祛痰作用的試驗研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011,9.